0 引言

昆虫与人类的生活息息相关，许多昆虫在授粉、生产工业原料、捕食害虫等方面为人类做出了重要贡献。除了这些益处之外，昆虫作为食物直接被人类食用也是不可忽视的利用途径之一^[1]。昆虫作为食物开发具有营养丰富、种类多样、生物量大、易饲养、食物转化率高、生活周期短等一系列优点，目前已经越来越受到人们的关注。2012年1月在联合国粮农组织总部意大利罗马召开一次会议，邀请专家对昆虫作为食物和饲料的潜力和安全性做评估^[2]。2013年联合国粮农组织与荷兰瓦格宁根大学合作召开一次全球性会议，在全世界范围内推行昆虫作为食物和饲料的观念。

蜻蜓目昆虫是重要的水生食用昆虫种类，世界上许多国家的居民都有食用蜻蜓的习俗。在中国、泰国、墨西哥等国，蜻蜓都是常见的食用昆虫，稚虫和成虫均可食用，营养价值很高^[3]。曾对印度曼尼普尔地区的5种水生食用昆虫做了营养分析，其中包括红蜻Crocothemis servilia (Drury)，它的蛋白含量高于其他4种水生昆虫，干重含量达到70.48%，可作为大力开发的食用昆虫对象^[4]。我们曾^[5]分析了云南常见的3种食用蜻蜓的营养价值，分别为红蜻(C. servilia)、角突箭蜓Gomphus cuneatus(Needham)、舟尾丝蟌Lestes praemorsus(Selys)，结果显示这三种蜻蜓均含有较高的蛋白质含量，且必需氨基酸含量较高，可作为一类营养价值高的昆虫食品。分析西南地区常见的6种食用蜻蜓的营养价值，结果表明6种蜻蜒稚虫的含油率(干基)为5.72%~11.90%^[6]。脂肪酸种类众多，组成较为复杂，不饱和脂肪酸(UFA)尤其是多不饱和脂肪酸(PuFA)含量高，具有一般昆虫和水生昆虫油脂的特点，6种蜻蜒稚虫油脂中均含有多种陆生动植物油脂中缺乏的珍贵脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、奇数碳脂肪酸(OCFA)等，可作为二十碳长链脂肪酸的来源之一平衡人体需求。

全世界的蜻蜓有6 000余种，中国记录约650种，是世界上蜻蜓多样性最丰富的国家之一^[7]。目前我国报道过的食用蜻蜓种类已有12种^{[5, 6, 8]}，如表 1所示。2016年收集到一种不同于已报道的12种食用蜻蜓种类，该种稚虫是当地村民从稻田的浅水中捕捉，收集一定量后自家食用或拿到市集上出售(未发表)。食用时采用油炸的方式或与小鱼小虾一起炒食。由于蜻蜓常见的虫态为成虫，稚虫生活于水中不易发现，因此目前对蜻蜓的形态分类(包括命名)主要还是依据成虫的形态，而依据稚虫形态进行分类的相关知识较少。新发现的这种食用蜻蜓只有稚虫，从形态上不能确定究竟是何种蜻蜓，因此我们决定从分子生物学的角度来分析该蜻蜓的物种归属，同时，为进一步观察成虫形态，我们留取部分稚虫在静水中饲养待其羽化。

1 材料与方法 1.1 稚虫的收集和成虫的获取

蜻蜓稚虫收集于云南红河州元阳县大坪乡，103°00′~103°10′E, 20°50′~22°59′N。该种稚虫体型中等偏小，体褐色，体长182~19.6 mm，头宽5.5~6.0 mm，后翅芽约6.2~6.6 mm，后腿节6.0~6.3 mm。腹部椭圆形，第8和9腹节具发达的侧刺，无背钩，肛附器发达，末端尖锐。前颏近似扇形，前部中央向前突起，下唇须叶甚阔，从形态上判断可能属于赤蜻属(Sympetrum)或黄蜻属(Pantala)，还需要从分子的角度对其种类归属进一步分辨。选取10只稚虫提取DNA，其余稚虫在静水中以红线虫饲喂，待其羽化，羽化后选取10只成虫提取DNA。

1.2 样品总DNA的提取

先将样品在STE中浸泡过夜(STE: 0.1 mol/L NaCl; 10 mol/L Tris-HCl, pH 8.0; 1 mol/L EDTA, pH 8.0), 去离子水冲洗后晾干，剪取胸部肌肉组织，再以饱和氯化钠法来提取总DNA。所需的试剂和药品有：DNA提取缓冲液(1% SDS, 50 mmol/L Tris-Cl, 25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA)；蛋白酶K；饱和NaCl溶液(6 mol/L)；100%乙醇；70%乙醇；TE (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0)或灭菌ddH₂O。

具体操作步骤如下：①取约1 g的组织, 置于200 μL的DNA提取缓冲液中，于-20 ℃冷冻10 min后, 用眼科剪剪碎, 匀浆；②加入20 μL蛋白酶K(20 mg/mL), 55 ℃恒温震荡器放置过夜；③加入180 μL NaCl (6 mol/L), 终浓度≤2.5 mol/L, 于旋涡混合器上高速混合20 s, 15 000 r/min于Eppendorf-5418离心机上离心30 min, 移上清至另一离心管(移取量应比液体总量少10~20 μL, 且操作宜轻柔缓慢, 避免吸入下层沉淀)；④加入2倍体积100%冰乙醇(-20 ℃预冷)，上、下颠倒5次，至溶液彻底混匀，15 000 r/min离心15 min, 移液器缓慢移出上清, 70%预冷乙醇洗涤两次；⑤吸去痕量乙醇，冷冻干燥15~20 min后加入50 μL的TE或灭菌ddH₂O溶解，4 ℃储存备用。

1.3 DNA条形码片段的扩增和测定

以提取的总DNA为模板，采用DNA条形码通用引物LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)来扩增标准片段COI (线粒体细胞色素C氧化酶Ⅱ)基因序列^[9]。PCR仪为Bio-rad T100，PCR反应体系为50 μL：含DNA模板1 μL (约120 ng), 10× PCR buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL, 引物(10 mmol /L) 2 μL, TaqDNA聚合酶(5 U/L) 0.25 μL, 无菌双蒸水37.75 μL。PCR反应参数为：95℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 50℃复性30 s, 72℃延伸1 min, 共35个循环; 72℃后延伸10 min^[10]。PCR产物用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物大小用DNA marker (TIANGEN, 中国)确定。为保证序列的准确性, 同时对每个样品的PCR产物进行双向测序, 测序由上海生工生物工程有限公司完成，测序仪器为ABI-3730XL基因测序仪。为增加分子数据的可信度，我们增加了核基因ITS2(内部转录间隔区2)序列的采集来辅助分类鉴定，对于ITS2片段的扩增，PCR条件、引物、热循环程序参照文献[11]。

2 结果与分析 2.1 形态鉴定

很多蜻蜓稚虫的形态相似，容易混淆，而成虫则相对容易辨认。本种食用蜻蜓的稚虫形态特征比较接近赤蜻属(Sympetrum)和黄蜻属(Pantala)，但也与斜痣蜻属(Tramea)和楔翅蜻属(Hydrobasileus)稚虫相识，从稚虫形态不能判断是何物种。羽化出的成虫体长26 mm，翅展68 mm，前胸黑色，前叶上缘及背板上面有赤褐色斑，后叶褐色，直立；合胸侧面红褐色，具黑色条纹，其中第一条纹与合胸背面的浓褐色条纹连成一体，第二、三条纹连于一体(图 1)；从成虫的形态特征上可以基本上确定该物种是黄基赤蜻(Sympetrum speciosum) (Oguma，1915)。

2.2 分子鉴定

10只稚虫和10只成虫均成功提取DNA, 经PCR扩增出线粒体COI基因序列和核基因ITS2序列。为检验20只样品中是否混有其他种的蜻蜓，对进化速率更快的COI基因进行了比对分析，结果表明20条COI基因序列之间彼此差异度均小于1%，表明这20只蜻蜓个体来自于同一物种。同时，这20只蜻蜓的总体核苷酸多样度为0.003，如此低的遗传多样度表明这些蜻蜓样本可能是来源于较少的几只蜻蜓的繁衍后代。通过COI基因序列与Barcoding数据库和GenBank数据库比对，该种蜻蜓与黄基赤蜻凭证标本的COI基因序列的遗传一致性程度达到了99%(图 2)，表明该物种确实就是黄基赤蜻。

为增加分子数据的可信度，我们还增加了核基因ITS2序列的采集来辅助分类鉴定，ITS2序列的比对结果显示该种晴蜒与黄基赤蜻(GenBank序列号：AB707293)的一致性程度为100%，确认该物种为黄基赤蜻无误。本研究所测的黄基赤蜻的COI基因和ITS2基因的序列已转换为二维码图片在本文中附上，读者扫描二维码获取基因序列后即可在GenBank或Barcoding数据库进行参考和比对(图 3)。

3 讨论

蜻蜓是人们十分熟悉的昆虫，主要分布在热带和亚热带地区^[13]。我国西南各省至今仍有食用蜻蜓的风俗习惯, 目前在国内报道的可食用种类(加上本文新报道的一种)已有13种。蜻蜓还是我国民间常用的药用动物之一^[14]，具有很好的保健价值^[15]。《中国药用动物志》记载红蜻干燥全虫入药，有补肾益精、解毒消肿、润肺止咳等功效，主治阳痿遗精、咽喉肿痛、百日咳等。李时珍在其著作《本草纲目》中也对药用蜻蜓的种类及其药效进行了记载^[16]。

不论是食用还是药用，准确的种类鉴定是安全食用和药用的基础，尤其是药用，不同的种类对应的药效不同，因此对于种类的鉴定更是马虎不得。由于蜻蜓目稚虫生活在水中不为常见，对蜻蜓分类特征的描述多是基于成虫的，蜻蜓稚虫的鉴定一直存在一定的难度。而像本文一样，把稚虫饲养至羽化后观察成虫在很多时候难以实现。即便是能够得到成虫，在没有深厚的分类学背景知识的情况下也很难把待定物种准确划定到种。同时，大多数蜻蜓的食用虫态都是稚虫，很难得到成虫，因此对食用蜻蜓种类的鉴定就不能单纯依靠形态分类。

DNA条形码技术是近年来快速发展的物种分子鉴定技术，是一种采用有足够变异的标准化短基因片段对物种进行快速准确鉴定的生物身份识别系统。它同传统的形态学鉴定相比具有许多独到的优势，比如不需要非常扎实的分类学知识为基础就可以鉴别形态相似种。线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因是进化速率适宜的DNA序列^[17]，Hebert等^[18]曾在鳞翅目200个近缘种中利用COI基因来鉴定种类，其成功率为100%。COI基因变异速度较快，适合区分亲缘关系较近的相似种，本文中的蜻蜓稚虫COI基因序列与黄基赤蜻凭证标本COI基因序列的一致性为99%，足以支持二者为同一物种。我们为进一步确认分子分类的准确性，同时还扩增了核基因ITS2的基因序列进行验证，而ITS2基因的进化速率较慢，本文中的蜻蜓稚虫ITS2基因序列与黄基赤蜻比对结果一致性达到了100%。

综上，本文在仅获取稚虫的基础上，提取稚虫DNA条形码序列，同时把部分稚虫饲养羽化为成虫，进而观察形态数据进行分类鉴定。结果表明，从稚虫提取DNA即可准确快速地鉴定出该种蜻蜓为黄基赤蜻，显然比羽化出成虫之后再测量各项数据进行鉴定来的更为方便快捷。因此，在需要对不常见、难识别的稚虫或幼虫进行种类鉴定的时候，笔者推荐采用DNA条形码分子鉴定技术，毕竟准确的物种鉴定是开发和利用一种昆虫的前提和基础^[19]。